DOI: 10.1051/vetres:2001101

Vet. Res. 32 (2001) 165-173

Single dilution ELISAs using soluble piroplasm, cellular schizont and soluble schizont antigens for the detection of antibodies against Theileria annulata

Anju Manuja^a, Anil K. Nichani^b, Rakesh Kumar^c, Rameshwer D. Sharma^d and Balwinder Kumar<sup>a

a</sup>  Central Institute for Research on Buffaloes, Hisar (Haryana) 125 001, India
^b  AICRP on Blood Protista, College of Veterinary Sciences, CCS Haryana Agricultural University, Hisar (Haryana) 125 004, India
^c  Department of Veterinary Clinical Medicine, CCS Haryana Agricultural University, Hisar (Haryana) 125 004, India
^d  Department of Veterinary Epidemiology and Preventive Medicine, CCS Haryana Agricultural University, Hisar (Haryana) 125 004, India

(Received 4 September 2000; accepted 19 December 2000)

Abstract
Single dilution ELISAs were standardised for the determination of antibody titres against Theileria annulata using three antigens namely soluble piroplasm, cellular schizont or soluble schizont antigens. Antibody titres of 20 cattle serum samples of known identity were determined by multi-dilution ELISA using the three antigens. The ratio of the optical density (OD) of known positive and known negative sera at different serum dilutions were calculated and termed as positive/negative (P/N) ratios. Coefficients of correlation (r) were calculated between the P/N ratios at different dilutions of known sera and their log₁₀ antibody titres by multi-dilution ELISA. The value of "r"was the highest at the dilution of 1:400. From the log₁₀ antibody titres of known sera and their P/N ratios at the dilution of 1:400, regression equations (Y = a + bX, where Y = predicted log₁₀ titre, X = the P/N ratio at 1:400 dilution) were calculated separately for the three antigens. Thus, the equations Y = 1.63 + 1.35X for soluble piroplasm, Y = 2.67 + 0.547X for cellular schizont and Y = 1.817 + 0.663X for soluble schizont antigens were derived. Test sera were diluted to 1:400 and their OD were read in duplicate wells and converted to P/N ratios. The antibody titres were predicted from the P/N ratios using the above mentioned regression equations. Twenty randomly selected sera tested by single and multi-dilution ELISAs showed non-significant differences ( P < 0.01) between antibody titres. Antibody titres of 90 unknown field sera of cattle were determined by single dilution ELISA. The piroplasm antigen detected higher antibody titres followed by cellular schizont and soluble schizont antigens. The study revealed that a single dilution ELISA could be successfully used for field epidemiological studies of tropical theileriosis.

Résumé
ELISA à dilution unique utilisant l'antigène de piroplasme soluble, de schizonte cellulaire ou de schizonte soluble pour la détection d'anticorps contre Theileria annulata . Un ELISA à dilution unique a été standardisé pour la détermination des titres en anticorps contre Theileria annulata, en utilisant trois antigènes : l'antigène de piroplasme soluble, de schizonte cellulaire, ou de schizonte soluble. Les titres en anticorps de 20 échantillons de sérums d'identité connue ont été déterminés par un ELISA à dilutions multiples, avec les trois antigènes. Le rapport de la densité optique (DO) de sérums positifs connus sur la DO de sérums négatifs connus, à différentes dilutions, a été calculé et a été appelé le rapport positif/négatif (P/N). Le coefficient de corrélation (r) entre les rapports P/N de sérums connus et leur titre en anticorps (log₁₀) déterminé par ELISA à dilutions multiples, a été calculé pour différentes dilutions des sérums. La plus forte valeur de "r "correspondait à une dilution de 1/400. A partir des titres (log10) en anticorps de sérums connus et leur rapport P/N à une dilution 1/400, des équations de régression ont été calculées séparément pour chaque antigène (Y = a + bX, où Y = titre prédit en log₁₀ ; X = rapport P/N à la dilution 1/400). Les équations suivantes ont ainsi été dérivées : Y = 1,63 + 1,35X pour le piroplasme soluble ; Y = 2,67 + 0,547X pour le schizonte cellulaire, et Y = 1,817 + 0,663X pour le schizonte soluble. Les sérums testés ont été dilués à 1/400 et leurs DO ont été lues chacune dans deux puits puis converties en rapport P/N. Les titres en anticorps ont été prédits à partir des rapports P/N, en utilisant les équations de régression correspondantes. Vingt sérums sélectionnés au hasard ont été testés à la fois par ELISA à dilutions multiples et par ELISA à dilution unique ; il n'y a pas eu de différence significative entre les titres en anticorps obtenus par les deux méthodes ( P < 0,01). Les titres en anticorps de 90 sérums prélevés sur le terrain ont été déterminés par ELISA à dilution unique. Dans ces échantillons, l'antigène de piroplasme détectait les anticorps aux titres les plus élevés, suivi du schizonte cellulaire, puis du schizonte soluble. L'étude a révélé que l'ELISA à dilution unique peut être utilisée avec succès dans des études épidémiologiques de terrain sur la theilériose tropicale.

Key words: Theileria annulata / single dilution ELISA / piroplasm / schizont / regression

Mots clés : Theileria annulata / ELISA à dilution unique / piroplasme / schizonte / régression

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