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| Issue |
Vet. Res.
Volume 31, Number 6, November-December 2000
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| Page(s) | 565 - 572 | |
| DOI | https://doi.org/10.1051/vetres:2000140 | |
| How to cite this article | Vet. Res. (2000) 565-572 | |
DOI: 10.1051/vetres:2000140
Vet. Res. 31 (2000) 565-572
Construction of an internal standard used in RT nested PCR for Borna Disease Virus RNA detection in biological samples
Vincent Legay - Corinne Sailleau - Gwenaëlle Dauphin - Stéphan Zientara
Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments d'Alfort,
22 rue Pierre Curie, 94704 Maisons-Alfort Cedex, France
(
Abstract:
The highly neurotropic Borna Disease Virus (BDV), which belongs to the Mononegavirales
order - Bornaviridae family - is generally detected using the RT-nested-PCR. If false
positive results (often caused by laboratory contaminations) can be avoided, some false
negative results which are mostly due to inhibitory effects of some reaction components
and/or to sample preparation errors, can occur. Thus, in order to control the RT-PCR
sample, an RNA internal standard molecule named "mimic'' was constructed with the same
primer recognition sites as the viral nucleic acids, flanking a heterologous DNA fragment
of distinct molecular weight. Because of their different sizes, the mimic and viral PCR
products can be easily discriminated by agarose gel electrophoresis. The co-amplification
of both BDV and mimic RNA was performed on infected cells and on biological tissues such
as the brain and blood, commonly known to contain PCR inhibitor components. After mimic
sensitivity studies were achieved (2.5 fg of "p40 RNA mimic'' and 0.25 fg of "p24
RNA mimic''), the competitive amplification reaction between both BDV and mimic RNA
was performed on these tissues. The results confirmed that nervous tissue has an
inhibitory effect on RT-PCR, which supports the necessity of BDV detection by a higher
sensitive method such as RT nested PCR. Moreover, these results confirmed the interest of
an internal standard for BDV RNA detection in biological samples.
Keywords:
Borna virus / PCR / internal standard / biological tissue
Résumé:
Construction d'un témoin interne de RT-PCR nichée pour la détection du génome du virus de
la maladie de Borna dans des tissus biologiques. Le génome du virus de la maladie de Borna
(" Borna disease Virus '' - BDV), du fait des propriétés biologiques de ce virus, n'est
généralement détectable que par la méthode RT-PCR nichée. Si les résultats
" faux-positifs '' peuvent être évités par des conditions de manipulation très strictes,
les résultats " faux-négatifs '' demeurent bien souvent une source d'erreurs biaisant les
résultats de la détection de génome viral. Ainsi, pour contrôler la RT-PCR dans chaque tube
réactionnel, un témoin interne ARN appelé " mimic '' a été développé. Cette molécule
comprend les sites de reconnaissance des amorces utilisées pour l'amplification du génome
du virus Borna et un fragment génomique de séquence et de taille différentes de celles du
BDV. Les fragments amplifiés de BDV ou de " mimic '' peuvent ainsi être facilement
différenciés par un gel d'électrophorèse. La réaction de co-amplification a été testée
tout d'abord à partir d'ARN extraits de surnageants de cultures cellulaires infectées par
le virus Borna, puis à partir d'ARN extraits d'échantillons biologiques tels que des
cerveaux et des prélèvements sanguins. La sensibilité de la détection par
RT-PCR (2.5 fg " d'ARN mimic p40 '' et 0.25 fg " d'ARN mimic p24 '') des deux molécules
a ainsi été étudiée et les résultats obtenus ont confirmé une inhibition de la RT-PCR
réalisée dans les tissus nerveux. Cette conclusion montre d'une part la nécessité
d'utiliser une méthode plus sensible que la simple RT-PCR telle que la RT-PCR nichée,
et d'autre part l'intérêt du témoin interne de réaction lors de la recherche du génome
du virus de la maladie de Borna dans des tissus biologiques.
Mots clé :
virus Borna / PCR / témoin interne / tissu biologique
Correspondence and reprints: Stéphan Zientara
Tel.: (33) 1 49 77 13 12; fax: (33) 1 49 77 13 13;
e-mail: s.zientara@afssa.fr
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