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Issue
Vet. Res.
Volume 31, Number 6, November-December 2000
Page(s) 565 - 572
DOI http://dx.doi.org/10.1051/vetres:2000140
How to cite this article Vet. Res. (2000) 565-572
DOI: 10.1051/vetres:2000140

Vet. Res. 31 (2000) 565-572

Construction of an internal standard used in RT nested PCR for Borna Disease Virus RNA detection in biological samples

Vincent Legay - Corinne Sailleau - Gwenaëlle Dauphin - Stéphan Zientara

Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments d'Alfort, 22 rue Pierre Curie, 94704 Maisons-Alfort Cedex, France

(Received 11 April 2000; accepted 29 June 2000)

Abstract:

The highly neurotropic Borna Disease Virus (BDV), which belongs to the Mononegavirales order - Bornaviridae family - is generally detected using the RT-nested-PCR. If false positive results (often caused by laboratory contaminations) can be avoided, some false negative results which are mostly due to inhibitory effects of some reaction components and/or to sample preparation errors, can occur. Thus, in order to control the RT-PCR sample, an RNA internal standard molecule named "mimic'' was constructed with the same primer recognition sites as the viral nucleic acids, flanking a heterologous DNA fragment of distinct molecular weight. Because of their different sizes, the mimic and viral PCR products can be easily discriminated by agarose gel electrophoresis. The co-amplification of both BDV and mimic RNA was performed on infected cells and on biological tissues such as the brain and blood, commonly known to contain PCR inhibitor components. After mimic sensitivity studies were achieved (2.5 fg of "p40 RNA mimic'' and 0.25 fg of "p24 RNA mimic''), the competitive amplification reaction between both BDV and mimic RNA was performed on these tissues. The results confirmed that nervous tissue has an inhibitory effect on RT-PCR, which supports the necessity of BDV detection by a higher sensitive method such as RT nested PCR. Moreover, these results confirmed the interest of an internal standard for BDV RNA detection in biological samples.


Keywords: Borna virus / PCR / internal standard / biological tissue

Résumé:

Construction d'un témoin interne de RT-PCR nichée pour la détection du génome du virus de la maladie de Borna dans des tissus biologiques. Le génome du virus de la maladie de Borna (" Borna disease Virus '' - BDV), du fait des propriétés biologiques de ce virus, n'est généralement détectable que par la méthode RT-PCR nichée. Si les résultats " faux-positifs '' peuvent être évités par des conditions de manipulation très strictes, les résultats " faux-négatifs '' demeurent bien souvent une source d'erreurs biaisant les résultats de la détection de génome viral. Ainsi, pour contrôler la RT-PCR dans chaque tube réactionnel, un témoin interne ARN appelé " mimic '' a été développé. Cette molécule comprend les sites de reconnaissance des amorces utilisées pour l'amplification du génome du virus Borna et un fragment génomique de séquence et de taille différentes de celles du BDV. Les fragments amplifiés de BDV ou de " mimic '' peuvent ainsi être facilement différenciés par un gel d'électrophorèse. La réaction de co-amplification a été testée tout d'abord à partir d'ARN extraits de surnageants de cultures cellulaires infectées par le virus Borna, puis à partir d'ARN extraits d'échantillons biologiques tels que des cerveaux et des prélèvements sanguins. La sensibilité de la détection par RT-PCR (2.5 fg " d'ARN mimic p40 '' et 0.25 fg " d'ARN mimic p24 '') des deux molécules a ainsi été étudiée et les résultats obtenus ont confirmé une inhibition de la RT-PCR réalisée dans les tissus nerveux. Cette conclusion montre d'une part la nécessité d'utiliser une méthode plus sensible que la simple RT-PCR telle que la RT-PCR nichée, et d'autre part l'intérêt du témoin interne de réaction lors de la recherche du génome du virus de la maladie de Borna dans des tissus biologiques.


Mots clé : virus Borna / PCR / témoin interne / tissu biologique

Correspondence and reprints: Stéphan Zientara
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